通常來說，免疫雜交技術是基于分子大小分離蛋白的一種技術，蛋白越小，它在凝膠中的遷移速度就越快，但是遷移還會受其他因素的影響，因此，觀察到的條帶的實際位置與所預期的有可能不同。常見的影響因素有：
1）翻譯后修飾，比如磷酸化，糖基化等，這些變化會增加蛋白的大小。
2）翻譯后剪切，比如很多蛋白在合成的時候是作為前提蛋白合成的，然后剪切形成活性形式，比如天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶前體。
3）剪切異構體，同一基因經選擇性剪切可能產生不同大小的蛋白。
4）相對電荷，氨基酸組成（帶電荷與不帶電荷）。
5）多聚體，比如蛋白二聚化。盡管強相互作用會導致大分子量條帶的出現，但是通常還原條件會抑制這種情況發生。
眾所周知的p53蛋白，其表觀分子量是53kDa（這也是該蛋白名字的由來），但是根據氨基酸序列計算得到的分子量卻是43kDa。